El cargo de Gran Esposa Real o Ta hemet nesu fue Nefertiti quién era de una gran belleza, y posiblemente tenía unas grandes dotes, pues con ella la figura de la Gran Esposa Real alcanzó cotas nunca vistas. Cabe mencionar que no existen registros de un faraón reinante y su principal esposa, ambos portando cartuchos reales. Una teoría sostiene que llegó a ser corregente junto a su marido con el nombre de Neferneferuatón. Incluso se piensa que, a la muerte de su marido se convirtió en reina-faraón durante un corto periodo de tiempo con el nombre de Semenejkara.
También destacó la figura de Kiya, mencionada como "La amada esposa" esposa secundaria de Ajenatón, quién muy probablemente haya cobrado relevancia por dotar de un hijo varón al rey, el príncipe Tut-anj-Atón, el futuro Tut-anj-Amón (Tutankamon).
Asimismo, como era costumbre en los reyes de la dinastía XVIII, heredó de su padre Amenhotep III el harén real, que incluía a la princesa mitannia Taduhepa fruto de un tratado diplomático, enviada para fortalecer aún más las relaciones entre Egipto y Mitanni durante el reinado de su padre Amenhotep III.
Ajenatón tuvo una numerosa prole de su unión con Nefertiti, prácticamente todas niñas.