En su dilatada carrera, describió 2.686 nuevas especies para la ciencia pertenecientes a diversas familias de plantas y hongos.
Una vez finalizados sus estudios, Spegazzini parte hacia Sudamérica en 1879 con la intención de abordar el estudio de los hongos de la región. Tras una breve estadía en Brasil, donde se le imposibilita permanecer a causa de una epidemia de fiebre amarilla que afectaba a este país, arriba hacia fines de ese año a Argentina.
En 1880 es incorporado al Gabinete de Historia Natural de la Facultad de Ciencias Físico-Naturales de la Universidad de Buenos Aires, donde publica sus primeros trabajos en los Anales de la Sociedad Científica Argentina, siendo su primer hongo descripto el Agaricus platense.
En 1881 participa de la expedición ítalo-argentina “Bove” a la Patagonia, llegando hasta Tierra del Fuego, donde descubre y cataloga 1108 especies, de las cuales 461 eran hongos dados a conocer en dos trabajos de su autoría titulados Fungi Fuegiani de 1888 y Fungi Argentini de 1898.
El naufragio de la corbeta que trasladaba a los científicos por el Cabo de Hornos lo obliga a rescatar su herbario y su cuaderno de notas llevándolos a nado hasta la costa. La contingencia le da la posibilidad de conocer las culturas indígenas de Tierra del Fuego y aprender las lenguas fueguinas, a partir de lo cual se basa para escribir en el futuro un compendio de gramática alakaaluf.
Radicación y obra en La Plata
Tras su regreso de Tierra del Fuego, Spegazzini integró la comisión encargada de definir el emplazamiento de la nueva capital de la Provincia de Buenos Aires, La Plata; donde establece definitivamente su residencia desde 1884, participando de la fundación de la Universidad Provincial de La Plata (desde 1905 Universidad Nacional de La Plata).Allí se desempeña como docente en Ciencias Naturales, Agronomía, Química y Farmacia y crea el Arboretum de la Facultad de Agronomía. También organiza y supervisa la plantación de árboles en el Paseo del Bosque de la naciente ciudad.
Posteriormente, Carlos Spegazzini integró más de 20 expediciones con fines científicos por Argentina, Chile, Brasil y Paraguay.