A la grandiosidad de la catedrales hay que dotarla de un ritual espectacular donde la música tiene la misión de ensalzar la obra arquitectónica y continuar la glorificación de Dios.
Hacia 1440 las piezas polifónicas vocales penetran en Castilla y Aragón con fuerza. La música instrumental vendrá representada por el órgano, que con rapidez ocupa los espacios de las catedrales y las iglesias arciprestales.
El Cardenal Cisneros, con la reforma de la capilla del Corpus Christi para el rito mozárabe, con su propia música, introdujo en la misma otro órgano.
También se encuentran otros en el resto de capillas importantes: la de los Reyes Nuevos -que dispone de dos-, la del Alcázar, la de la Virgen del Sagrario y la de San Pedro.
No sólo el órgano fue importante. Con el paso de los años se introdujeron instrumentos de viento (chirimías, flautas y sacabuches), arpas y otros instrumentos de cuerda, como la denominada viola da braccio, que servían de acompañamiento a la música vocal. Con la creación de la Capilla de Música a lo largo del siglo XVI y XVII se irá incorporando el oboe y el contrabajo, en perjuicio de la chirimía y el sacabuche.
Los Seises o Escolanía de la catedral fueron creados como grupo vocal por el Cardenal Silíceo quien, el 22 de julio de 1557, fundó para ellos el Colegio de Nuestra Señora de los Infantes, aunque con anterioridad ya se mencionaba en el siglo XII de la existencia de moços que cantaban en los actos litúrgicos.
La carta constitucional, otorgada por Silíceo el 9 de mayo de 1557, prescribía taxativamente en su punto sexto:
«... mandamos que aya otro maestro que enseñe a los dichos clerizones a cantar canto llano y canto de órgano y contrapunto, del qual assi mismo se aya informaçión cómo es xpi.ano viejo, conforme al Statuto, Saçerdote y de buena fama y nombre y bastante docto en la facultad de Música, el qual enseñe a los dichos clerizones a cantar todos los días de fiestas y domingos una hora antes de comer, y otra después de hauer comido, y otra después de completas, y los otros días lectivos les dé cada día una lectión después de auer çenado»Entre los maestros de capilla, destacó Cristóbal de Morales (En línea Emendemus in melius y Peccatem me Quotidie), que había trabajado en la Capilla Sixtinade Roma y que llegó a componer 21 misas y más de 70 motetes; Jaime Casellas, Matías Durango de los Arcos, Alonso Lobo, Juan de Bonet y Paredes, Andrés de Torrentes, Miguel de Ambiela, Ginés de Boluda y Francisco Juncá y Carol.
La influencia de la música de la catedral de Toledo fue decisiva en la música religiosa española. No sólo en el canto mozárabe, sino también al aportar maestros de capilla que fueron después a otras diócesis como Sevilla o Jaén, seises que formaron coros en otras catedrales y hasta variaciones sobre el Canto gregoriano en la forma de lo que se conoce como Cantus Eugenianus, Cantus Melodicus o Vulgo Melodía, propio de los maestros melódicos de la catedral (se han datado hasta dieciocho maestros; su figura desaparece con el Concordato de 1851) y cuyas composiciones se conservan en la biblioteca catedralicia en su mayor parte.