Técnicas de estudio en Bioquímica

La Bioquímica es una rama de la ciencia que relaciona la Biología con la Química, y que se ocupa del estudio de las moléculas que componen los seres vivos, en particular de las que son exclusivas de la materia viva, aunque también estudia tangencialmente de las moléculas inorgánicas que están presentes en los organismos y de los elementos que forman parte de ellas.
Uno de los aspectos más complejos del estudio de estas moléculas está en que los seres vivos presentan en su interior una gran diversidad de sustancias químicas, muchas de ellas con propiedades químicas y físicas parecidas pero con función biológica distinta, que resultan muy difíciles de separar para poder estudiarlas individualmente.
Aunque algunos estudios bioquímicos pueden realizarse con el individuo vivo, lo más habitual es que sea necesario obtener una sustancia y aislarla antes de poder caracterizarla e identificar sus propiedades.
El caso más general es partir del estudio de un individuo completo. Si la sustancia que se pretende estudiar se encuentra en uno de sus fluidos corporales su obtención es relativamente sencilla, ya que basta con extraer una muestra de los mismos (sangre, líquido cefalorraquídeo...), normalmente mediante una punción con una jeringa.
Si, por el contrario, la sustancia que interesa conseguir está en el interior de las células su obtención se complica un tanto. En primer lugar, es necesario diseccionar al organismo para conseguir el órgano donde se quiere estudiar la sustancia en cuestión. A continuación es necesario disgregar el órgano para obtener una muestra de tejido y, por último en esta fase previa, homogeneizar el tejido para romper las células y poder acceder a las sustancias intracelulares.
Aunque existen varios métodos para romper las células (métodos mecánicos, uso de detergentes...), lo más habitual es hacerlo mediante la técnica de sonicación, es decir, aplicando ultrasonidos que hacen vibrar las células hasta romper sus membranas celulares, que acaban formando vesículas de pequeño tamaño (microsomas) y liberando los componentes celulares.
Con estos procedimientos se consigue una mezcla homogénea que incluye tanto los orgánulos celulares, que aún pueden estar intactos tras el tratamiento, como las moléculas que forman el interior de la célula. Para individualizar estos componentes se recurre a diferentes técnicas de separación, que permiten separar dichos componentes en función de sus características físico-químicas. El resultado final de aplicar estas técnicas de separación será obtener una cierta cantidad de moléculas de un único tipo cuyo estudio mediante técnicas analíticas es el objetivo fundamental de la Bioquímica.
La primera técnica de separación es la centrifugación, que consiste en provocar una sedimentación acelerada del homogeneizado mediante la aplicación de una fuerza centrífuga. Gracias a la aceleración provocada, los componentes más pesados se depositan en el fondo de un tubo mientras que los más ligeros permanecen flotando en el líquido. Cambiando la fuerza aplicada y o el tiempo que dura la centrifugación es posible separar distintos componentes celulares.
Tanto el líquido (sobrenadante) como el sedimento (pellet) pueden utilizarse para estudios posteriores, el sobrenadante directamente, y el sedimento reconstituyéndolo con un tampón hasta disolverlo.
Esta es una técnica muy utilizada para separar entre sí diferentes elementos estructurales de la célula, mediante lo que se conoce como "centrifugación fraccionada". Aunque los datos concretos de tiempos y fuerzas aplicadas cambian de unos tipos celulares a otros, se puede generalizar el procedimiento para separar los diferentes elementos celulares:
El homogeneizado celular obtenido en la sonicación se centrifuga a baja velocidad, con lo que sedimentan las células enteras que puedan haber quedado, los núcleos celulares y restos del citoesqueleto. Si no nos interesa ninguno de estos componentes el sobrenadante se separa del precipitado recuperándolo mediante una micropipeta y se vuelve a centrifugar, esta vez a velocidad media. El precipitado obtenido en esta ocasión incluye fundamentalmente las mitocondrias. Si el nuevo sobrenadante se centrifuga a alta velocidad se separan las vesículas pequeñas en las que se había roto la membrana y otros orgánulos membranosos, quedando en la parte líquida los ribosomas, las macromoléculas y, de haberlos, los virus, componentes que pueden precipitar en una centrifugación a muy alta velocidad. El último sobrenadante contiene las sustancias solubles que forman parte de la célula.

Un enfoque diferente, pero basado en el mismo principio, es la centrifugación en gradiente de densidad. En este caso el tubo de centrifugación se prepara con varias soluciones de densidad creciente, situando la más densa en la parte baja del mismo. La muestra se sitúa sobre la solución menos densa y entonces se centrifuga.
Los diferentes componentes de la muestra se mueven hacia el fondo del tubo hasta alcanzar la parte del mismo cuya densidad es igual a la del propio componente, deteniéndose en ese punto. Una vez finalizada la centrifugación se perfora el tubo por su parte inferior, recogiéndose individualmente cada una de las fracciones en las que se ha separado la muestra.


Separación molecular
Las moléculas orgánicas suelen tener propiedades químicas bastante parecidas, por lo que su separación debe hacerse basándose en sus propiedades físicas, tales como el tamaño, la carga eléctrica, la polaridad, la volatilidad, la solubilidad o la adsorción.
El tamaño y la carga eléctrica son propiedades sobradamente conocidas, que no necesitan mayor explicación. La polaridad es una característica de ciertas moléculas que presentan una distribución irregular de carga eléctrica en su estructura, de modo que pueden establecer interacciones electrostáticas con otras moléculas, tanto cargadas como polares, mientras que las moléculas apolares interaccionan con otras moléculas apolares.
La volatilidad es la tendencia que tiene una molécula a pasar al estado gaseoso, mientras que la solubilidad es la capacidad de una sustancia para que sus moléculas se mezclen homogéneamente con las de otra. Depende, en buena parte, de la polaridad de las dos sustancias (solvente y soluto). Finalmente la adsorción es un fenómeno mediante el cual determinadas moléculas interaccionan con un soporte sólido. También depende de la polaridad.
Todos las técnicas de separación física comparten un mismo fundamento básico. Las moléculas que se van a separar se mueven a través de un medio dado. El movimiento está causado por una fuerza impulsora, e impedido por una o varias fuerzas retardadoras, de modo que la velocidad a la que se mueve cada tipo de molécula es diferente, y de pende de sus características físicas. Al cabo de un tiempo, cada tipo  de molécula habrá recorrido una cierta distancia, diferente a la que han recorrido los otros tipos de moléculas, lo que permite su separación.
La filtración consiste en separar los componentes de una mezcla haciéndola pasar a través de un material poroso (filtro) que solo deja pasar las partículas más pequeñas que el tamaño del poro.
En este caso la fuerza impulsora suele ser la gravedad, es decir, la muestra simplemente se deja caer a través del filtro, aunque también se puede ejercer presión (por ejemplo con una jeringa) o aplicar vacío y succionar para acelerar y mejorar la eficacia del proceso. La fuerza que se opone al movimiento es la propia resistencia del material. En la actualidad es posible utilizar este método (en realidad la ultrafiltración) para separar macromoléculas (10³ a 10⁶ Daltons).
La  diálisis es también un método de separación  por tamaño. En este caso en lugar de un filtro se utiliza una membrana semipermeable, que permite el paso de moléculas de pequeño tamaño (solutos) pero no el de macromoléculas. La disolución de trabajo se introduce en una bolsa de diálisis, cuyas paredes están formadas por una membrana de este tipo, y la bolsa completa se sumerge en agua destilada o en una disolución muy poco concentrada. La "fuerza impulsora" es la diferencia de concentración entre el interior y el exterior de la bolsa. Las moléculas tienden a moverse hasta igualar esas concentraciones, pero las macromoléculas no pueden atravesar la membrana. Esta técnica permite concentrar macromoléculas o eliminar sales de una disolución, lo que no es posible con la filtración.
Una de las técnicas más utilizadas en la purificación de macromoléculas, especialmente de proteínas, es la cromatografía. La separación cromatográfica se basa en el reparto desigual de un soluto entre dos fases que son inmiscibles entre sí, como resultado de que el soluto tiene una solubilidad distinta en las dos fases. Una de las dos fases o medios está en reposo, mientras que la otra se mueve a lo largo de la fase inmóvil en una dirección determinada.
Existen diferentes tipos de cromatografía, según la naturaleza de las dos fases que intervienen y el principio en el que se basa la serparación de los componentes de la muestra.  La siguiente tabla muestra una clasificación simple de los principales tipos de cromatografía.
En la mayor parte de los casos la cromatografía utiliza como herramienta un instrumento llamado columna cromatográfica (son excepciones la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina, en las que la que la fase estacionaria es o está fijada sobre un soporte sólido). La columna cromatográfica es un tubo que se carga por la parte superior y en cuya parte inferior hay algún dispositivo (lo más sencillo es una llave o un grifo) que regula la salida de la fase móvil. Cuando se "carga" la columna se empieza por rellenarla con la fase estacionaria. Luego se hace pasar por ella la fase móvil, en general una solución con un pH controlado (un tampón). Finalmente, se "pincha" muestra en la parte superior y se sigue dejando pasar tampón el tiempo necesario.
La cromatografía de exclusión (también llamada filtración en gel) separa moléculas en función de su tamaño. La fase estacionaria es un gel, una suspensión de partículas que tienen la particularidad de que su interior está perforado, formando una red de canalillos de distintos diámetros. Cuando la muestra circula a lo largo de la columna, las moléculas de mayor tamaño solo pueden moverse por los espacios que quedan entre las partículas del gel, mientras que las más pequeñas pueden circular también por los espacios que quedan en su interior. En consecuencia, las moléculas más pequeñas recorren caminos más largos (estictamente, la longitud del camino recorrido es inversamente proporcional al tamaño de la molécula), de modo que tardan más tiempo en atravesar la columna, lo que permite la separación.
La eficacia de la separación cromatográfica puede mejorarse si se consigue que algunas moléculas interaccionen de forma aún más intensa con la fase estacionaria, y más aún si esa interacción es específica, es decir, si las únicas moléculas de la muestra que se unen a la fase estacionaria son las que se desean separar. El primer caso describe la cromatogrfía de intercambio iónico, en la que la fase estacionaria es un gel cargado eléctricamente. de modo que las macromoléculas con carga eléctrica opuesta se unen firmemente a él. El resto de las moléculas recorre la columna y son eliminadas. Al final, la unión entre las moléculas aisladas y el gel puede deshacerse cambiando el pH del medio, lo que modifica las cargas eléctricas.
En el caso de la cromatografía de afininidad, se establece una relación específica entre la molécula que se desea separar y la fase estacionaria. Este tipo de interacciones son muy habituales entre moléculas biológicas presentándose, por ejemplo, entre las enzimas y sus respectivos sustratos, o entre los antígenos y los anticuerpos que los reconocen. Por lo tanto, para preparar una columna cromatográfica de este tipo es necesario contar con una de esas moléculas. El caso más general, aunque no es el único posible, es partir de una pequeña cantidad de la sustancia que queremos purificar y obtener un anticuerpo contra ella, inyectándola en un animal de laboratorio y extrayendo después esos anticuerpos. Luego los anticuerpos obtenidos se unen covalentemente a las partículas del gel, creando así una fase estacionaria que tiene una afinidad específica por la molécula a separar.
Cuando se carga la columna con la muestra que se desea separar, solo las moléculas que presentan afinidad por el gen quedan retenidas en el gel, mientras que el resto dejan la columna junto con el tampón. Para recuperar las moléculas unidas es necesario separarlas del gel, lo que se consigue, en general, cambiando el pH de la fase móvil.
La electroforesis consiste en el movimiento de partículas y moléculas cargadas eléctricamente a través de un medio, impulsadas por un campo eléctrico. La dirección en la que se mueven las moléculas depende del signo de su carga, y la velocidad con la que lo hacen es función, por una parte, del valor de dicha carga, y por otra de las características del medio y de cómo interaccionen con él las moléculas.  El soporte de la eletroforesis es un gel formado por algún tipo de polímero, en general agarosa si se quieren separar moléculas de ADN y poliacrilamida para separar proteínas. Independientemente de su naturaleza química, los geles tienen una estructura porosa irregular que se opone al avance de las moléculas, ofreciendo mayor resistencia a las de mayor tamaño. De este modo, cuando se separan entre sí moléculas de naturaleza homogénea (diferentes proteínas o fragmentos de ácidos nucleicos), la velocidad de migración acaba siendo inversamente proporcional al tamaño de la molécula, aunque en el caso de las proteínas su forma tridimensional tiene una gran influencia en su "tamaño efectivo", de modo que para separar eficazmente este tipo de moléculas es necesario alterar previamente su estructura, lo que se consigue tratándolas con un detergente iónico.
Una vez separadas mediante electroforesis, las moléculas pueden ser recuperadas y utilizadas para análisis posteriores. Para ello basta con cortar el fragmento de gel donde se encuentran las moléculas y disolver el gel.