El transcriptoma en cerebros con Alzheimer muestra diferencias en el splicing

Introducción
  Un reciente estudio, publicado en “PLoS one” el pasado viernes 21 de enero, mejora la comprensión del transcriptoma de tejido cerebral afectado por la enfermedad de Alzheimer. Un equipo de científicos de la Universidad de Nueva Gales del Sur, en Sídney (Australia), utilizando una poderosa técnica de secuenciación de todo el transcriptoma (RNA Seq), ha encontrado expresión diferencial de genes, genes que emplean promotor alternativo y patrones de “splicing” que cambian junto con la neurodegeneración.
  En vez de trabajar, como es habitual, con modelos de enfermedad de Alzheimer basados en animales transgénicos o con líneas celulares procedentes de personas enfermas, se han arriesgado con el Homo sapiens sapiens (Linnaeus, 1758) optando por tejido cerebral humano post mortem procedente de empresas biotecnológicas norteamericanas. Resulta de sobra conocido que con este material siempre hay problemas que afectan a la calidad del tejido nervioso, lo que en este caso concreto puede afectar al estudio del transcriptoma, pero bueno algún grupo tiene que arriesgarse que luego ya se verá hasta qué punto es acertado el trabajo. El artículo, sin ser excesivamente ambicioso, es muy alentador porque los resultados ahondan en una hipótesis de trabajo muy prometedora para descifrar los enigmas que plantea esta horrible enfermedad. La investigación se ha llevado a cabo sobre los lóbulos frontal y parietal, y sobre cerebro total.
La enfermedad de Alzheimer
  La enfermedad de Alzheimer es la primera causa de demencia en seres humanos, y aunque realmente se desconoce su etiología existen diferentes hipótesis algunas de las cuales le atribuyen causas genéticas. Se manifiesta por una pérdida de memoria y de otros procesos cognitivos, así como por la presencia de síntomas no cognitivos como delirios, agitación, y con cambios de humor y personalidad. Siendo características claves de la neuropatología de la enfermedad la extensa pérdida neuronal unida a la presencia extracelular de las placas neuríticas o seniles, compuestas del péptido beta amiloide, y la presencia de los ovillos neurofibrilares (intraneuronales) descritos ya por el famosos neurólogo y psiquiatra alemán Aloysius Alzheimer (1864-1915). Los ovillos están compuestos de filamentos de la forma hiperfosforilada de la proteína tau asociada a microtúbulos. A falta de una mejor comprensión de la patogénesis de esta enfermedad, las estrategias de tratamiento realmente no curan porque se limitan a abordar los síntomas y a reducir su tasa de comienzo ya que desde el mismo momento del diagnóstico se ve reducida la esperanza de vida del paciente, que a partir de ese momento se encuentra entre los 3 y los 20 años.
El transcriptoma, el mRNA y la tecnología RNA-Seq
  El transcriptoma es el RNA mensajero (mRNA) y por tanto el reflejo de la actividad de la RNA polimerasa del tejido en un momento dado. Una vez terminada la transcripción, el mRNA madura en un proceso conocido como “splicing” en el que se van eliminando los intrones del mRNA precursor, una vez finalizados los mecanismos post-transcripcionales el mRNA consta únicamente de secuencias derivadas de exones que el ribosoma traduce en una proteína. Gran variedad de moléculas de señalización se dedican a realizar el “splicing alternativo” de intrones en un gen, introduciendo así una gran variabilidad en las proteínas traducidas a partir del mismo gen, aunque ocasionalmente estos mecanismos post-transcripcionales fallan generando un mRNA anómalo.
  Este tipo de estudios de amplia expresión del genoma, en principio, al no estar influenciados por asunciones deductivas, proporcionan una aproximación interesante a la investigación de la patogénesis de enfermedades complejas como la de Alzheimer o el cáncer.
  En estos momentos, en los que se puede decir que vivimos inmersos en la era post-genómica, al hablar de secuenciadores de alto rendimiento debemos comentar que una de las tecnologías más poderosas de secuenciación de siguiente generación, “Next-generation sequencing”, NGS por sus siglas en inglés y que también se traduce como de próxima generación o de nueva generación, es la RNA-Seq, la cual nos da el poder de realizar nuevas observaciones biológicas gracias a una secuenciación más barata y eficiente, operando con fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos que eso si, obligan a realizar un esfuerzo considerable en el desarrollo de herramientas informáticas para tratar los enormes ficheros de datos que se obtienen. La RNA-Seq secuencia el DNA complementario (cDNA) por medio de métodos altamente eficientes de secuenciación de DNA (NGS) y posteriormente mapea los fragmentos de corta secuencia resultantes (reads) sobre el genoma de referencia. Esta nueva tecnología hace posible identificar exones e intrones, mapear sus uniones, las terminaciones 3’ y 5’ de los extremos, y por añadidura posibilita la comprensión de la complejidad de los transcriptomas eucarióticos. La RNA-Seq también permite identificar los sitios de iniciación de la transcripción (TSSs) y las variantes de nuevo splicing permitiendo la precisa determinación cuantitativa de la expresión del exón y de las isoformas del splicing. ¡Impresionante! Faltan palabras para alabar las bondades de estos nuevos logros de la biología molecular.
  En resumen, las NGSs proporcionan herramientas más finas que facilitan la comprensión de los análisis del transcriptoma, por ejemplo, algunos informes recientes que comparan sistemáticamente microarrays y NGS han probado claramente la superioridad de lo último con respecto a la baja frecuencia de las señales de falsos positivos y a la alta reproductividad del método.
Genética de la apolipoproteína E
  La apolipoproteína E (Apo E) es un polipéptido de 299 aminoácidos, con gran importancia en el metabolismo lipídico. Es sintetizada fundamentalmente en el hígado, aunque también se genera en cerebro, riñones y bazo. En el sistema nervioso central (SNC) es producida principalmente por las células de Hortega y por los astrocitos.
  Su gen es pleomórfico con 3 alelos principales. El normal es el e3, mientras que las isoformas e2 y e4 están detrás de diferentes enfermedades genéticas. Estos otros alelos son el producto de mutaciones que provocan la codificación de dos aminoácidos diferentes en las posiciones 112 y 158. Siendo e2 (Cys-112 y Cys-158), e3 (Cys-112 y Arg-158) y e4 (Arg-112 y Arg-158). Por tanto, tenemos 6 genotipos, tres heterocigotos (e2/e3, e2/e4 y e3/e4) y tres homocigotos (e2/e2, e3/e3 y e4/e4). El e3/e3 es el genotipo normal y se observa en el 60% de la población. El e2/e2 provoca hiperlipoproteinemia de tipo III asociada a ateroesclerosis, niveles altos de colesterol, etc. Los genotipos e4/e4 y e3/e4 se relaciona con altos niveles de colesterol, así como con la enfermedad de Alzheimer y con problemas en el desarrollo cognitivo. Sin embargo, hay que aclarar que la tercera parte de los pacientes de la enfermedad de Alzheimer no posee el alelo e4 y hay casos en los que el genotipo e4/e4 no desarrolla la enfermedad. La ApoE es reconocida por su receptor específico, salvo la isoforma e2 que no es reconocida por ningún receptor.
El fondo del trabajo
  Hasta ahora los estudios de transcriptoma en relación con la enfermedad de Alzheimer usando tejido cerebral habían proporcionado resultados bastante discordantes y este, aun siguiendo en la misma línea, aporta novedades que lo hacen más interesante.
  En el estudio de estos investigadores australianos se ha realizado un análisis comparativo de la expresión génica de tejido cerebral humano normal y afectado por la enfermedad de Alzheimer, usando la poderosa técnica RNA-Seq. Han analizado muestras de mRNA de todo el cerebro, del lóbulo temporal y del frontal. Se eligieron estas localizaciones por la forma en la que evoluciona el mal, se sabe que los ovillos neurofibrilares primero aparecen en la corteza entorrinal del lóbulo temporal medial y desde ahí se extienden hacia la región CA1 del hipocampo; regiones cerebrales relacionadas con la memoria. La formación de los ovillos entonces progresa hacia el neocórtex frontal y temporal.
Al comparar tejido sano y enfermo han encontrado diferencias significativas en los niveles de expresión de genes isomorfos, un uso diferencial de promotores y diferentes sitios de inicio de la transcripción. La expresión génica diferencial se encontró en el conjunto del cerebro, en el lóbulo frontal y en el temporal. En los tres casos encontraron diferencias significativas que los autores consideran debidas a niveles generales más bajos de la actividad transcripcional en el cerebro de los enfermos de Alzheimer en los que la pérdida de tejido neuronal es manifiesta.
  En general, las diferencias observadas concuerdan con estudios previos de microarrays sobre la enfermedad de Alzheimer, aunque hay discrepancias en algunos genes. Resulta enormemente llamativa la mayor expresión en los cerebros afectados por la enfermedad de Alzheimer de genes relacionados con la muerte neuronal programada o apoptosis. La sobreexpresión de estos genes eutanásicos se relaciona con el proceso neurodegenerativo y la muerte celular asociada.
  Una de las características clave del RNA Seq es su capacidad de identificar el splicing alternativo de los transcritos, por lo que el descubrimiento de que las muestras de tejido enfermo muestran menores niveles de variantes de splicing es muy interesante, al igual que la observación de que el mapeo de las lecturas para las muestras del genoma de referencia muestran diferencias en los niveles de expresión de exones ApoE individuales. También llama la atención el posible splicing alternativo diferencial porque el análisis detallado de los transcritos revela tres isoformas ApoE trascripcionales diferentes en las muestras de lóbulo temporal: APOE-001 y APOE-002 contienen el exón 1 mientras que la APOE-005 es generada por un promotor alternativo (cadena arriba del segundo exon de ApoE).
  Sin embargo, resulta discordante la identificación de los alelos ApoE del cromosoma 19 presentes en las muestras de los cerebros enfermos porque las muestras de los lóbulos temporales y la muestra para cerebro total eran homocigóticas para el alelo e3, mientras que la del lóbulo frontal era heterocigótico: e3/e2. Por lo que aún estamos lejos de comprender el riesgo que representa el alelo ApoE e4 y su posible interacción mecanística con la patología beta-amiloide.
  Ahora podemos comprender el transcriptoma de tejido cerebral afectado por la enfermedad de Alzheimer, gracias a la identificación de los niveles de expresión diferencial en diferentes genes, al establecimiento de los genes que emplean promotor alternativo y a saber qué patrones de splicing cambian en relación con la neurodegeneración. Además el análisis comparativo de las muestras obtenidas de diferentes regiones cerebrales ha aportado una “mayor resolución molecular” con esta investigación. Los lóbulos temporal y frontal no sólo difieren en la composición cuantitativa de los genes expresados, sino que también muestran alteraciones específicas de lóbulo en el ensamblado de los transcritos. Por todo lo cual este trabajo apoyaría la idea de que la alteración del control transcripcional de los genes implicados en la fisiología neuronal estaría estrechamente relacionada con la neurodegeneración. Como se ha visto con anterioridad en el splicing alternativo de ciertos receptores en cerebros enfermos: transportador de glutamato, PIN1, alfa de estrógeno, y el de ApoE. La observación de una expresión alternativa de ApoE junto a los informes previos sobre el patrón de splicing alternativo del receptor ApoE ahondan en la idea de la gran relevancia funcional del metabolismo lipídico en la patología de la enfermedad de Alzheimer.
  Un saludo
Referencia
Twine NA, Janitz K, Wilkins MR, Janitz M (2011) Whole Transcriptome Sequencing Reveals Gene Expression and Splicing Differences in Brain Regions Affected by Alzheimer's Disease. PLoS ONE 6(1): e16266. doi:10.1371/journal.pone.0016266