Nacido en 1535, fue el menor de los hijos del matrimonio formado por John Dudley, primer duque de Northumberland, y de Jane, hija de sir Edward Guildford. El linaje Dudley se remonta a una familia llamada Sutton, señores del castillo de Dudley, desde el siglo XIV. El abuelo paterno de Guilford, Edmund Dudley, que era consejero de Enrique VII, fue ejecutado tras morir el rey; mientras que su abuela paterna, Elizabeth Grey, vizcondesa de Lisle, era descendiente de los héroes de la Guerra de los Cien Años, Richard de Beauchamp, conde de Warwick, y John Talbot, conde de Shrewsbury.
Los hijos de los Dudley —trece en total— pudieron disfrutar de una educación humanista, igual que la futura esposa de Guilford, lady Jane Grey, y la princesa Isabel. Siendo rey Eduardo VI, John Dudley, fue nombrado Presidente del Consejo Privado, y, por lo tanto, gobernó Inglaterra entre los años 1550 a 1553. Richard Grafton, lo describe como «un caballero apuesto, virtuoso y bueno».
En 1552, Northumberland intentó, en vano, casar a Guilford con Margaret Clifford, prima de Jane Grey, pero, en su lugar, en 1553, fue comprometido con la propia Jane, la cual ocupaba un puesto más alto en la línea de sucesión al trono que Margaret. El 21 de mayo y los días sucesivos, se celebraron tres bodas en Durham Place, (la mansión existente en la ciudad del duque de Northumberland): Guilford se casó con Jane; Katherine, hermana de Guilford, casó con Henry Hastings, heredero del conde de Huntingdon; y Catalina, hermana de Jane, con Henry Herbert, heredero del conde de Pembroke. A los festejos se invitó a los embajadores de Francia y Venecia, además de los principales señores del reino. En ella, Guilford junto a otros, sufrieron una Intoxicación alimentaria, por un error del cocinero.
En su lecho de muerte, el rey Eduardo, estableció que la corona sería para su prima Jane Grey, pasando por encima de sus medias hermanas e Isabel. El 6 de julio de 1553, tras la muerte del rey, el duque de Northumberland se dispuso a cumplir la voluntad del fallecido rey Eduardo. Los enviados del Sacro Imperio Romano Germánico y de Francia, estaban seguros del éxito, y aunque Jane se mostró reacia a aceptar la corona, tuvo que ceder tras las protestas de una asamblea de nobles encabezadas por sus padres y sus suegros; también intervino Guilford para convencerla. El 10 de julio, hizo su entrada triunfal, la pareja, en la Torre de Londres, caminando juntos bajo un dosel.
Instalados en la torre, Guilford y Jane, discutieron cuando aquel manifestó su deseo de ser rey. Jane estuvo de acuerdo en convertirlo, únicamente, en duque de Clarence, a lo que Guilford se opuso, partiendo en búsqueda de su madre, la cual, furiosa, se puso del lado de su hijo, prohibiéndole dormir con su esposa, y que abandonara la Torre y volviera a casa. Jane insistió en que permaneciera en la corte a su lado. Desde entonces, las reuniones diarias del Consejofueron presididas por Guilford; ya que Jane, como monarca, no asistiría. Las comidas se servían a la pareja real en pabellón estatal, donde Guilford, con tratamiento real, cenaba solo.
El mismo día de la proclamación de Jane, llegó a Londres una carta de María Tudor, en la que afirmaba ser la nueva reina y exigía la obediencia del Consejo. María reunió a sus partidarios en Anglia Oriental, donde se decidió atacar. Hubo un breve debate para decidor quien debía dirigir el mismo, consiguiendo Jane, que no fuera su padre el elegido; por lo que el duque de Northumberland marchó a Cambridge con sus tropas. Allí permaneció durante una semana sin realizar ninguna acción, hasta que, el 19 de julio, se enteró que el Consejo en Londres se había declarado en favor de María. Northumberland también la proclamó en el mercado, siendo detenido a la mañana siguiente.
La mayor parte del Consejo Privado se mudó de la Torre. Cuando el padre de Jane, se dio cuenta del cambio de opinión de sus colegas, abandonó el mando sobre la fortaleza y proclamó a María. Poco después, Jane fue trasladada a los alojamientos de los guardias y Guilford fue encarcelado en la torre del campanario, donde se le unió su hermano Robert; el resto de sus hermanos, junto a su padre, fueron encarcelados en distintas torres.
El 12 de agosto, la pareja fue acusada, y Jane pidió perdón, mediante una carta, por la acusación, al tiempo que informaba a la reina sobre la verdad de los acontecimientos. Todos los acusados fueron juzgados el 14 de noviembre de 1553, siendo declarados responsables de alta traición. A María le molestaba tener que dejar morir a su prima; pero el embajador imperial, y los miembros del Consejo Privado, se impusieron. El día antes de la ejecución, Guilford solicitó una entrevista con su esposa, a lo que Jane se opuso, ya que pensaba que solo aumentaría su miseria y dolor. A las diez de la mañana del 12 de febrero, Guilford fue llevado a Tower Hill, donde tras dar la mano a algunos caballeros allí reunidos. pronunció un breve discurso, tras lo cual, se puso de rodillas, oró y pidió a la gente que orara por él. Fue ejecutado con un golpe de hacha, siendo su cuerpo transportado en un carro a la Capilla Real de San Pedro ad Vincula en la Torre de Londres. Fue enterrado en la capilla junto a Jane, quien murió una hora después.