Desarrollan un metodo de biologia molecular.

(Los acentos fueron obviados por cuestiones tecnicas)
Mariana Nuñez, cientifica del Centro de Quimica Aplicada de la Facultad de Ciencias Quimicas, desarrollo una tecnica capaz de reconocer la presencia de estos patogenos virales en el plasma humano. El exito del metodo radica en una secuencia de ADN que la investigadora diseño a medida para encontrar regiones conservadas del genoma de esos virus por tecnicas de biologia molecular, y que permite amplificar el material genetico de esos agentes infecciosos hasta hacerlos visibles a traves de un equipo especial.
Los analisis serologicos tradicionales que se practican para determinar si una persona esta infectada con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o Hepatitis C, son indirectos. No detectan a los agentes patogenos por si mismos, sino a los anticuerpos que genera el sistema inmunologico del organismo infectado como defensa. El tiempo que demoran estos en aparecer varia entre tres y doce semanas, pero esta comunmente aceptado que estos anticuerpos pueden ser reconocidos con certeza entre 45 y 50 dias posteriores al contagio. Durante ese “periodo de ventana”, los estudios convencionales brindaran resultados negativos, aunque la sangre de la persona portadora podra contagiar mediante transfusiones sanguineas o relaciones sexuales en las que no se utilicen metodos profilacticos.
¿Como saber, entonces, si un donante no se encuentra en ese periodo de ventana al momento de someterse a una extraccion de sangre? La respuesta viene de la mano de la biologia molecular, una disciplina que estudia la estructura, funcion y composicion de las moleculas biologicamente importantes. En este caso, la molecula analizada es el acido ribonucleico (ARN), constituyente del material genetico de los virus HIV y Hepatitis C.
Mediante la aplicacion de tecnicas de biologia molecular, una cientifica de la Universidad Nacional de Cordoba (UNC) desarrollo un metodo cualitativo directo que permite identificar la presencia de ARN especifico correspondiente a los virus del VIH y la Hepatitis C en el plasma humano. Su principal ventaja radica en su especificidad, ya que reconoce secuencias de ARN propias de los virus de HIV y Hepatitis C, y en su mayor sensibilidad, lo que permite reducir el periodo de ventana a solo 11 dias. La tecnica en cuestion se denomina “retrovirus.')" >transcriptasa reversa acoplada a la reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real” (RT/RT-PCR, por sus siglas en ingles) y es el proceso en el que durante casi dos años trabajo para optimizar y poner a punto Mariana Nuñez, coordinadora del Area Quimica Molecular del Centro de Quimica Aplicada (CEQUIMAP) de la Facultad de Ciencias Quimicas. El diagnostico que resulta del metodo es inequivoco, porque se detecta el material genetico de los virus y, desde noviembre de 2008, se aplica a todas las extracciones que realiza el Banco de Sangre de la Universidad Nacional de Cordoba.

En terminos simples, el proceso consiste en multiplicar exponencialmente el material genetico de los virus -si es que estan presentes en la muestra analizada- hasta hacerlos “visibles” mediante un equipamiento especifico. El metodo posee una estricta serie de pasos, pero la clave de su exito radica en la secuencia de ADN que posibilita y sirve de molde para su amplificacion y deteccion.
Precisamente, es esta secuencia de ADN la que diseño a medida la investigadora del Cequimap, utilizando informacion de los genomas de cepas de VIH y Hepatitis C aisladas en Argentina.
La metodologia fue desarrollada a partir de un convenio con el Instituto de Hematologia y Hemoterapia (IHH) de la UNC. El Banco de Sangre de esta Casa de Estudios la aplica desde noviembre de 2008, en forma complementaria a los estudios serologicos tradicionales que fija la legislacion sobre las normas de medicina transfusional. Su inclusion apunta a asegurar la calidad de la sangre disponible en esa dependencia sanitaria; y mediante esta tecnica, el Cequimap analiza aproximadamente unas 600 muestras sanguineas mensuales remitidas por el IHH.
El abece del material genetico.
Para comprender el metodo, es necesario partir algunas nociones basicas. El ADN (acido desoxirribonucleico) es la informacion genetica basica que se transmite de una generacion a otra y que codifica los datos necesarios para la sintesis de proteinas indispensables para el funcionamiento de la celula o particula viral.
El ADN esta conformado por combinaciones de cuatro bases nitrogenadas denominadas “nucleotidos”: adenina (A), timina (T), guanina (G) y citosina (C), unidas en dos ejes de azucar-fosfato. Como polos opuestos de un iman, la adenina siempre estara apareada a la timina y la guanina a la citosina, y viceversa (en combinaciones A-T, T-A, C-G y G-C). Graficamente, una molecula de ADN es representada como una doble helice, es decir, como una escalera caracol, cuyos peldaños se mantienen unidos por dos cadenas o hebras en sus extremos. En este modelo, los escalones son las uniones A-T, T-A, C-G y G-C, mientras que las hebras son ejes de azucar-fosfato que funcionan como un esqueleto.

Sin embargo, en algunos virus -como VIH y Hepatitis C- el material genetico que se encuentra en moleculas de ARN, tambien esta compuesto por cuatro bases nitrogenadas: adenina (A), uracilo (U), guanina (G) y citosina (C). Estos virus se conocen como retrovirus; el nombre hace referencia a que poseen un modo inverso de replicar el acido nucleico. Es decir, a partir de ARN sintetizan el ADN virico que sirve de molde para obtener multiples copias de ARN viral. Esta reaccion es catalizada por la enzima denominada transcriptasa reversa.

Eureka.
Mientras conducia por una carretera en 1983, el bioquimico Kary Mullis -que trabajaba en una empresa de biologia molecular radicada en California- ideo una tecnica in vitro para generar, a partir de una unica molecula de ADN, millones de copias identicas en pocas horas. Fue denominada “reaccion en cadena de la polimerasa” (o PCR, por sus siglas en ingles). El funcionamiento de esta tecnica reside en someter un fragmento de ADN a una temperatura de 95°C durante un periodo de entre 30 y 60 segundos, la doble hebra de ADN se separa. En esta etapa, denominada “desnaturalizacion”, se rompen los puentes de hidrogeno que mantienen conectadas las adeninas y las citosinas de una hebra, con las timinas y las guaninas de la otra hebra, respectivamente.

Cuando esto sucede, se agregan dos “primers” o “iniciadores”, pequeñas secuencias de nucleotidos que, al descender la temperatura a unos 55°C, se adheriran a cada una de las hebras individuales en los extremos de una region especifica, buscando los tramos de ADN que le son complementarios para aparearse.
Con la incorporacion de una enzima, denominada ADN polimerasa -una proteina que motoriza la reaccion de sintesis de ADN-, se generan las porciones faltantes de ambas hebras hasta obtener dos copias iguales de ADN doble hebra. Estos pasos conforman un ciclo que se repite aproximadamente 30 veces (por eso el termino “en cadena”) hasta obtener mas de mil millones de moleculas de ADN identicas. Todo esto ocurre dentro de un equipo especial denominado termociclador. Esta tecnica es muy utilizada en laboratorios de investigacion y de diagnostico molecular, y su versatilidad radica en el “primer” que diseñe el cientifico segun el fragmento de ADN que quiera amplificar.

La PCR solo es capaz de amplificar moleculas de ADN. Para el diagnostico molecular de los retrovirus, primero es necesario convertir sus moleculas de ARN a ADN, y esto es posible gracias a la enzima transcriptasa reversa. Recien a partir de este punto se puede aplicar la PCR, y es esto es lo que realiza el Cequimap para identificar los virus del VIH y la Hepatitis C en el plasma humano.
La metodologia, paso a paso.
En la Universidad Nacional de Cordoba, las extracciones se efectuan en el Instituto de Hematologia y Hemoterapia y de cada una se envia una muestra infima: 1,5 mililitros bastan para la comprobacion. De ella se extrae el plasma -que representa aproximadamente el 50 por ciento de su volumen- y se purifica con una serie de reactivos para separar el material genetico (ARN).
Mediante la transcriptasa reversa, ese ARN se convierte en ADN y se somete a la PCR. En este punto entran en juego los “primers” que diseño Mariana Nuñez. Se trata de secuencias de 26 nucleotidos, que son complementarias a regiones conservadas del ADN de cepas de referencia internacionales de los virus VIH y Hepatitis C, asi como el de sus variantes “criollas” (locales y regionales). Su desarrollo implico un extenso proceso de investigacion, porque si bien existen bases de datos con el mapa genetico de cada agente patogeno, el desafio fue encontrar, entre las multiples alternativas de combinacion, aquella que experimentalmente permitiera detectar el mayor rango de particulas virales.

¿Como se arriba al diagnostico? Como los primers diseñados corresponden a informacion genetica de los virus, podran adherirse unicamente cuando encuentren una region de ADN complementaria en una de las hebras del ADNc proveniente del ARN viral. De no detectar estas secuencias especificas, los primers no se alinearan y tampoco se producira la amplificacion de las moleculas, confirmando la ausencia de los virus de VIH y Hepatitis C.

Cabe señalar que el proceso que aplica el Cequimap se realiza en tiempo real. Es decir, mientras las reacciones ocurren dentro del termociclador, ciertas sondas fluorescentes indican si se produce la multiplicacion en cada ciclo de amplificacion. Esto agrega una sensibilidad dos veces mayor que la tecnica PCR tradicional, en la que el material procesado debe pasar por una ultima etapa para verificar si se produjo la multiplicacion. Esto implica manipular la muestra luego de la PCR, lo que incrementa el riesgo de contaminacion del ensayo, y con ello la posibilidad de que ocurran falsos positivos.

Como todo metodo, el RT/RT-PCR tiene sus limitaciones. En la actualidad, ningun metodo de diagnostico serologico o molecular asegura un riesgo de infeccion cero para el uso de sangre proveniente de donantes. Las restricciones estan dadas por la carga viral de VIH y Hepatitis C que posea el donante al momento de la extraccion de sangre. Ocurre que debajo de cierto umbral, la RT/RT-PCR no podra identificar la presencia de estos virus.
Validacion.
Para validar el metodo, se realizaron pruebas con paneles de cepas de diferentes serotipos y muestras con diferentes concentraciones de particulas virales, que son provistos por la Organizacion Mundial de la Salud y distribuidos por el National Institute for Biological Standards and Control (Reino Unido). En la actualidad, el Cequimap tramita la acreditacion del metodo ante el Organismo Argentino de Acreditacion bajo la norma NM ISO 15189:2008 (Laboratorios de analisis clinicos - Requisitos particulares para la Calidad y la Competencia), una gestion que las autoridades de ese centro de investigacion universitario preven completar para fines de 2009.
Andres Fernandez
Mail: comunicacion@rectorado.unc.edu.ar
Prosecretaria de Comunicacion Institucional
Universidad Nacional de Cordoba
Fuente: InfoUniversidades