Microscopía

La microscopía es el conjunto de métodos que se utilizan para poder visualizar objetos muy pequeños que están fuera del alcance de resolución del ojo humano.  La microscopía utiliza instrumentos especiales como la lupa y el microscopio (del griego mikros = pequeño, skopein = observar), que permiten magnificar el tamaño de estructuras imperceptibles, para lo cual emplea medidas de longitud que se detallan en la siguiente tabla.
El primer instrumento aparece en el año 1590, cuando  Z. Jansen fabrica un microscopio utilizando dos lentes convergentes dentro de tubos de latón, que al deslizarse facilitaban el enfoque. En 1612, Galileo Galilei diseña un pequeño microscopio usando dos lentes dentro de tubos de madera. 
Robert Hooke observa, en 1665, muestras de corcho en un microscopio compuesto. Llamó con el nombre de “célula” a cada una de las pequeñas celdillas que pudo visualizar. Años más tarde, Anton van Leeuwenhoek descubre las características de los glóbulos rojos, de los espermatozoides y de diversos microorganismos presentes en aguas estancadas.  En 1828, W. Nicol desarrolla la microscopía con luz polarizada. 
Robert Koch identifica, en el año 1880, los agentes bacterianos del cólera y de la tuberculosis y logra colorearlos con tinte de anilina. En 1908,  Köhler desarrolla el microscopio de fluorescencia. Lebedeff  fabrica el primer microscopio de interferencia en 1930. Dos años después, Zernike diseña el microscopio de contraste de fases. 
El microscopio electrónico, obra de E. Ruska y M. Knoll, aparece en el año 1937. G. Binnig y H. Rohrer inventan el microscopio de efecto túnel en 1981, que permite aumentos de cien millones de veces, revelando la estructura atómica de las partículas. Cinco años después, estos científicos se hicieron merecedores del premio Nobel de Física.
En la actualidad hay varios tipos de microscopios, que se diferencian de acuerdo a los sistemas de luz utilizados y a los distintos accesorios para obtener las imágenes. 
MICROSCOPIO SIMPLE 
Es el microscopio más elemental. También llamado lupa, aumenta la imagen de la muestra a observar alrededor de 10 a 15 veces. Para aumentar el objeto a observar, el microscopio simple utiliza una sola lente ocular biconvexa montada en un soporte que se conecta con una columna afirmada a una base o pie. Con este instrumento se pueden ver objetos densos como hojas de vegetales, patas de insectos, cabellos, etc.
    Microscopio simple

LUPA BINOCULAR

Permite observar imágenes tridimensionales o estereoscópicas de la muestra. Está compuesta por dos lentes oculares que tienen un aumento de 10X y 20X (la X significa aumento) para utilizar ambos ojos y lentes objetivos de 2X y 4X. Teniendo en cuenta que el aumento total de la imagen observada resulta del producto del ocular con el objetivo, la lupa binocular permite aumentos que van de los 20 a los 80 aumentos. Es muy útil para visualizar preparados relativamente grandes como componentes de disección, partes de insectos, hongos, estructuras vegetales (hojas, raíces, semillas), etc.
                                         Lupa binocular

MICROSCOPIO COMPUESTO

Este instrumento, que posee más de una lente, se utiliza para ver estructuras muy finas y transparentes, seccionadas en láminas muy delgadas. Además, esas estructuras tienen que ser coloreadas y atravesadas por una fuente de luz, natural o artificial, para una mejor visualización. Con estos instrumentos pueden observarse distintos tipos de células animales como glóbulos rojos, glóbulos blancos, espermatozoides o neuronas, y células vegetales con sus respectivas organelas como cloroplastos y vacuolas, entre otras. También es posible identificar diferentes clases de bacterias, hongos, huevos de parásitos y muchas estructuras de dimensiones microscópicas. En todos los casos, el material a observar es transparente y atravesado por una fuente luminosa.
Los microscopios ópticos compuestos pueden tener una sola lente ocular fija (monoculares) o dos oculares (binoculares). De esas dos lentes oculares, una de ellas es fija y la otra está sujeta a un tornillo, que al girarlo puede mover la lente hacia arriba y hacia abajo para lograr un mejor enfoque.
Los microscopios compuestos aumentan la imagen del preparado a observar entre 100 y 1500 veces. Están formados por tres componentes bien diferenciados.
1- Componente óptico
Formado por un sistema de lentes para aumentar la imagen que se está observando. Hay dos tipos de lentes llamados oculares y objetivos. El ocular está ubicado en la parte superior del microscopio, cercano al ojo del observador. Amplía la imagen formada en el objetivo y tiene aumentos de 5X, 10X y 15X.  

Los objetivos se encuentran cerca del preparado a visualizar, adheridos a una base giratoria llamada revólver, que permite intercambiarlos para ver imágenes de diferente tamaño. Hay objetivos denominados “secos” de 4X, 10X y 40X que se usan directamente sobre el preparado sin el agregado de ninguna sustancia. Para saber cuántas veces está aumentada la muestra que se está observando, hay que multiplicar los aumentos del ocular y del objetivo. Por ejemplo, un preparado enfocado con un ocular de 15X y un objetivo de 10X está aumentado 150 veces. Muchos microscopios ópticos compuestos vienen con un objetivo llamado “de inmersión”, que posee 100X. Se lo identifica porque en su parte lateral tiene inscripta  la palabra oil (aceite en inglés) u oleo (aceite en italiano). Para su utilización es necesario depositar una gota de aceite de cedro entre el preparado y el objetivo, con el fin de aumentar el índice de refracción y hacer más visible la imagen al estar más iluminada. Con el objetivo de inmersión y un ocular de 15X se obtiene un aumento de 1500 veces. 

2- Componente lumínico

Está integrado por un espejo, un condensador de luz y un diafragma.El espejo, solo presente en los microscopios sin luz propia, es de forma redonda. Tiene una cara plana para luz natural y otra cara cóncava para luz artificial. Los microscopios con fuente de luz propia utilizan una lámpara de tungsteno o un diodo emisor de luz o led (light-emitting diode).
El condensador concentra y proyecta el haz luminoso sobre el objeto a examinar, ya que posee un sistema de lentes convergentes en su interior. Los rayos de luz atraviesan el diafragma, disco con aberturas que está dentro del condensador y que regula la cantidad de luz que llega al preparado. Mediante una palanca lateral, se controla la intensidad luminosa de la imagen observada. 
3- Componente mecánico 
Permite sostener las lentes y el sistema de iluminación. La parte mecánica de un microscopio óptico compuesto consta de un pie o base, una platina, dos tornillos, un revólver, un tubo y un brazo. 
El pie es la parte inferior donde se apoya el microscopio.
La platina es la parte donde se coloca la muestra a visualizar. Tiene un orificio en la parte central que deja pasar los rayos de luz que vienen desde abajo. La platina puede ser fija o móvil. La fija viene con un sistema de pinzas para fijar el portaobjetos que contiene la muestra a observar. Cuando la platina es móvil se puede desplazar el portaobjetos en cuatro direcciones: adelante, atrás y hacia ambos costados. 
Los tornillos, llamados macrométrico y micrométrico, permiten acercar o alejar el objetivo de la muestra a examinar. Con el tornillo macrométrico se realizan desplazamientos máximos, con el fin de ubicar la imagen observada desde el ocular. El tornillo micrométrico asciende y desciende muy lentamente, focalizando y haciendo nítida la figura a visualizar.
El revólver contiene a los objetivos. Tiene forma cilíndrica y puede girarse para cambiar de aumento y alinearse con el ocular.
El tubo es un cilindro que contiene al ocular y a los objetivos. Está en contacto con el brazo mediante una cremallera.
El brazo es el componente que mantiene sujetos al tubo, a la platina y a los tornillos macro y micrométrico. Queda fijo a la base o se articula para cambiar de ángulo.
                         Microscopio compuesto monocular

                      Microscopio compuesto binocular

El microscopio compuesto binocular tiene dos tubos, uno para cada ojo del observador. Permite una mejor percepción de la muestra que se examina y una óptima nitidez de los detalles. El microscopio binocular es muy utilizado en bacteriología.

                   Tamaño relativo de estructuras microscópicas

PASOS PARA LA OBSERVACIÓN DE MUESTRAS

Objetivos secos (4X, 10X y 40X)

1) Bajar completamente la platina utilizando el tornillo macrométrico.
2) Colocar el objetivo de menor aumento en posición hacia la platina girando el revólver.
3) Ubicar el portaobjetos que contiene el preparado en la platina y sujetarlo correctamente.
4) Sin mirar por el ocular, iniciar el enfoque girando el macrométrico para situar la platina lo más cerca del objetivo de menor aumento.
5) Observando a través del ocular, bajar lentamente la platina girando el tornillo macrométrico para ir alejando el preparado del objetivo.
6) Ni bien se vea una imagen poco nítida o borrosa, girar el tornillo micrométrico hasta obtener un enfoque perfecto.
7) Para obtener una visión más detallada, cambiar el objetivo por otro de mayor aumento. Es probable que al realizar esta maniobra desaparezca la imagen anterior, con lo cual hay que volver a utilizar el objetivo anterior y repetir los pasos señalados. Otra opción es girar lentamente el tornillo micrométrico hasta obtener una imagen bien focalizada. Tener presente que el objetivo de 40X, al posicionarse muy cerca del portaobjetos, puede dañar el preparado al ejercer presión sobre el mismo. 

Objetivo de inmersión (100X)

1) Bajar completamente la platina utilizando el tornillo macrométrico.
2) Subir al máximo el condensador para que pueda verse sobre el preparado un círculo bien iluminado, sobre el cual se depositará el aceite de cedro.
3) Para tener espacio cuando se deposita el aceite, girar el revólver hasta que el objetivo de inmersión y el que está al lado queden en posición intermedia, es decir, que ambas lentes no estén dirigidas hacia la muestra.
4) Colocar en el círculo iluminado una sola gota de aceite de cedro.
5) Girar el revólver para posicionar sobre el preparado el objetivo de inmersión.
6) Subir lentamente la platina con el tornillo macrométrico hasta que el objetivo contacte con la gota de aceite.
7) Observar a través del ocular y girar el tornillo micrométrico hasta obtener una imagen nítida de la muestra a observar.
Al terminar la observación, bajar la platina y girar el revólver para colocar el objetivo de menor aumento en posición. Retirar el preparado y limpiar el objetivo de inmersión con papel para óptica.
CUIDADO Y MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO
- Cuando sea necesario cambiar el objetivo, girar el revólver dirigiendo la mirada hacia la lente, para controlar que no se choque con el preparado. Nunca cambiar de objetivo mientras se observa por el ocular. 
- Usar con delicadeza los componentes móviles del microscopio como tornillos, platina, condensador y revólver.
- Si se derramó algún líquido sobre la platina secarla con un trapo limpio. 
- Si se utilizó el objetivo de inmersión, limpiarlo suavemente con papel de óptica. Si quedó aceite pegado a la lente, limpiar con un trapo humedecido en xilol.
- Nunca tomar el microscopio del tubo o de la platina.
- Cuando sea necesario mover el microscopio de un lado a otro, tomarlo del brazo con una mano y de la base con la otra. 
- Al finalizar el trabajo, bajar la platina y colocar el objetivo de menor aumento en posición de observación.
- Controlar que no quede ninguna muestra sobre la platina.
- Cubrir el microscopio con una funda al terminar el trabajo.
- Esa conveniente que un técnico realice un ajuste, una limpieza y una revisión general del microscopio cada seis meses.

Fuente: "CIENCIAS BIOLÓGICAS" - http://hnncbiol.blogspot.com