Neutropenia cíclica en Collies. Monografías de alumnos

Nuevamente les dejo una monografìa de mi alumno Nicolás Cugliari  de 3er año de la carrera de Veterinaria de la Univ. Nacional de Río Negro, sobre una enfermedad hereditaria en caninos denominada NEUTROPENIA CICLICA EN CANINOS (Collies). Espero que les sirva a muchos otros en el camino del aprendizaje.

Neutropenia cíclica

Universidad Nacional de Río Negro
Genética Básica
2015 Cugliari Nicolás

Introducción

Neutropenia cíclica, también conocida como síndrome del Collie gris es una alteración autosómica recesiva, producida por la mutación del gen AP3B1 que afecta a la raza Collie. Se caracteriza por la disminución crítica en la cantidad de neutrófilos de manera cíclica. Esto deja vulnerable al animal al ataque de agentes bacterianos. Los animales afectados muestran una serie de signos y una dilución del color del pelaje que junto a técnicas de laboratorio permiten diagnosticar el desorden genético.

Enfermedad

La mutación provoca que las “stem cells” o células madre de la médula ósea funcionen de manera anormal. Este tejido se encarga de la formación y maduración de las células sanguíneas. Consecuentemente, esta afección genera trastornos en la producción de leucocitos. Entre estos, los más afectados son los neutrófilos, principales encargados de la fagocitosis y primeros defensores ante una infección. El recuento de neutrófilos en banda y segmentados puede dar 0 o un valor cercano. La actividad de los pocos neutrófilos circulantes se muestra desequilibrada e incapaz de cumplir sus funciones inmunológicas ante, principalmente, bacterias. Se ha observado que en ocasiones puede darse una disminución considerable de plaquetas, lo cual lleva a hemorragias. El número de otros glóbulos blancos puede disminuir sin tener grandes repercusiones. (Patt, et al. 1973.)
El proceso en perros infectados dura aproximadamente 20 días y se produce de manera repetitiva cada 2 a 10 días. El número de leucocitos se normaliza al cabo de una semana aproximadamente gracias a una serie de mecanismos de retoralimentación que tienen lugar en la médula ósea. (Dale, et al 1972)
La disminución de neutrófilos generada por este trastorno facilita el ingreso y la supervivencia de agentes bacterianos una vez dentro del perro. Por lo tanto, animales afectados son susceptibles a todo tipo de infecciones sobre todo bacterianas en piel, ojo y sistema respiratorio. (Lund, et al 1967)
Externamente la neutropenia cíclica genera una dilución en el color del Collie, alcanzando un color grisáceo y ocasionalmente beige.
Entre 8 y 12 semanas luego de nacer, los cachorros enfermos comienzan a manifestar los síntomas. Son de menor tamaño, más débiles y si no se los trata no llegan a superar el año de vida. Aún recibiendo el cuidado apropiado, es decir, siendo monitoreado y suministrado antibióticos, la expectativa de vida no supera los 4 años de vida. (Pacheco, et al 2008)

Herencia

La enfermedad solo afecta a perros que reciben dos copias del gen mutado, es decir, se hereda como recesivo. La misma puede manifestarse en algún punto de su vida. Los perros enfermos transmiten una sola copia de la mutación a sus descendientes.
A aquellos animales que tienen un solo gen mutado se los denomina portadores. No desarrollan la enfermedad pero tienen un 50% de probabilidad de transmitir una copia mutada del gen a sus descendientes.
Los perros que tienen dos genes normales son considerados libres, por lo tanto, no pueden trasmitir genes mutados ni desarrollar la enfermedad. A diferencia de los enfermos y portadores no manifiestan color gris plateado en el pelaje.
Gen AP3B1

El gen AP3B1 o adaptor-related protein complex 3, beta 1 subunit se encuentra en el cromosoma 3 del perro. Está formado por 25 intrones, 27 exones y una secuencia de nueve bases. Fue mapeado por medio de análisis de ligamiento de alta densidad. (Benson, et al 2004.)
Este codifica una subunidad del complejo proteico adaptador AP3, involucrado en el transporte de proteinas entre lisosomas y el complejo de Golgi, más específicamente, de la ELA 2 o neutrófilo elastasa. La subunidad del AP3 se asocia a la neutrófilo elastasa o ELA2 a través de una señal basada en la tirosina cerca a su extremo C-terminal y actuando como su transportador. (Meng, 2010.)

Mutación

La mutación consiste en la inserción de un residuo extra de adenina en una cadena de adeninas ubicadas en el exon 21 del gen AP3B1.
Perros heterocigota portadores, que tienen un alelo normal y uno mutado, producen una población homogénea de transcripciones normales del gen. En este caso contienen nueve adeninas en el alelo normal y diez en el mutado.
En el caso de perros homocigota afectados, que tienen dos alelos mutados, producen una población heterogénea de ARNm del AP3B1 conteniendo transcripciones mutadas con diez adeninas.
Las mutaciones en la subunidad beta del complejo A3 provocan inestabilidad del gen, haciendo que los neutrófilos de perros afectados tengan deficiencia en la elastasa. La deficiencia de ELA2 permite que se acumulen proteinas precursoras de la elastasa en sus gránulos primarios. (Meng, 2010)

Diagnóstico

El diagnóstico de la neutropenia cíclica se realiza mediante un hemograma que determine la disminución o en ocasiones ausencia de neutrófilos. Para ello se relacionan los signos manifestados y el color del pelaje.
El pelo sufre una dilución en el color tornándose gris plateado y puede que beige. Los animales enfermos presentan fiebre, diarrea, dolor en las articulaciones e infecciones cutáneas, oculares y respiratorias.
Para la detección de la mutación primero se obtuvo una secuencia parcial del cADN del gen AP3B1 para realizar un análisis northern-blot del ARN total extraído de la sangre del perro. La técnica llamada Northern-blot o ensayo Northern es similar al Southern-blot pero, este es utilizado en la detección de moléculas de ARN de una secuencia. Se toma una mezcla de ARN y se la somete a una electroforesis en gel. Se separan los fragmentos de acuerdo al tamaño y se los transfiere a una membrana cargada positivamente donde se produce la hibridación de una sonda molecular marcada radiactivamente. (Watson, 2004.)
La transcripción aparece ausente en el perro afectado y la mitad aproximadamente de la misma en portadores, comparándolos con animales de otras razas a modo de control.
A continuación se clonó completamente el cADN de AP3B1 aislando totalmente el ARN de la sangre del animal y realizando una carrera de 5’-3’. (Benson, KF., et al.)

Benson et. al, 2004

Los perros afectados mostraron dos secuencias de transcripción que diferían por la presencia de un residuo de adenina extra en la secuencia de nueve adeninas. Posteriormente se determinó la secuencia genómica del AP3B1 por un recorrido en los intrones a partir de los exones identificados en el cADN. Esto permite establecer primers para la amplificación de la secuencia de adeninas en el gen AP3B1 a partir de ADN genómico. La misma se realiza utilizando la técnica de PCR o reacción en cadena de polimerasa. Esta consiste en la síntesis de ADN por medio de la ADN polimerasa de manera automatizada a partir de cebadores. El proceso se da por complementariedad de bases. (Benson, KF., et al.)
Los resultados determinaron que Collies afectados son homocigota y los portadores heterocigota debido a la inserción de una adenina adicional en la secuencia de nueve adeninas. Dicha secuencia se ubica en el exon 21 del gen AP3B1.
La aparente auscencia de la transcripción del alelo mutado en heterocigotas es el resultado de una degradación selectiva de transcripciones mutadas.

Benson et al 2004

Tratamiento

La neutropenia cíclica puede ser curada por medio de transplante medular. Estos sin embargo, resultan poco práctico, limitándose el tratamiento solo a monitoreos y administración de antibióticos. Sin embargo, a pesar de los cuidados, los perros enfermos no superan los cuatro años de vida.

Referencias

• Benson, KF., Person, RE., Li, FQ., Williams, K., Horwitz, M. 1. 2004.
  Paradoxical homozygous expression from heterozygotes and heterozygous expression from homozygotes as a consequence of transcriptional infidelity through a polyadenine tract in the AP3B1 gene responsible for canine cyclic neutropenia. Nucleic Acids Res 32:6327-33, 2004. Pubmed reference: 15576359. DOI: 10.1093/nar/gkh974.
• Benson, K.F., Li, F.Q., Person, R.E., Albani, D., Duan, Z., Wechsler, J., Meade-White, K., Williams, K., Acland, G.M., Niemeyer, G., Lothrop, C.D., Horwitz, M. 2. 2003
  Mutations associated with neutropenia in dogs and humans disrupt intracellular transport of neutrophil elastase Nature Genetics 35:90-6, 2003. Pubmed reference: 12897784.
• Dale, D.C., Alling, D.W., Wolff, S.M. 1972
  Cyclic hematopoiesis: the mechanism of cyclic neutropenia in Grey Collie dogs Journal of Clinical Investigation 51:2197-2204, 1972. Pubmed reference: 5054472. DOI: 10.1172/JCI107027.
• Lund, J.E., Padgett, G.A., Ott, R.L. 1967.
  Cyclic neutropenia in Grey Collie dogs Blood 29:452-461, 1967. Pubmed reference: 6067150.
• Pacheco, J.M., Traulsen, A., Antal, T., Dingli, D. 2008.
  Cyclic neutropenia in mammals. Am J Hematol 83:920-1, 2008. Pubmed reference: 18951469. DOI: 10.1002/ajh.21295.
• Patt, H.M., Lund, J.E., Maloney, M.A. 1973
  Cyclic hematopoiesis in grey Collie dogs: a stem cell problem Blood 42:873-884, 1973. Pubmed reference: 4796766.
• Meng, R., Bridgman, R., Toivio-Kinnucan, M., Niemeyer, GP., Vernau, W., Hock, T., Lothrop, CD. :
  Neutrophil elastase-processing defect in cyclic hematopoietic dogs. Exp Hematol 38:104-15, 2010. Pubmed reference: 19941936. DOI: 10.1016/j.exphem.2009.09.010.
• Watson, J, D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R (2004). Molecular Biology of the Gene (Fifth edition edición). San Francisco: Benjamin Cummings. ISBN 0-321-22368-3.