Nacida en Lovaina, el 15 de noviembre de 1498, fue la hija primogénita de Felipe I de Habsburgo, archiduque de Austria y duque de Borgoña, y de Juana I, reina de Castilla. Fue célebre gracias a su extraordinaria belleza y cultura, siendo pretendida por reyes y condes de diversas naciones europeas. Siendo joven, su abuelo Maximiliano trató de desposarla con Enrique, príncipe de Gales, futuro Enrique VIII de Inglaterra, quien se desposaría con la hermana de su madre, la reina Juana, la infanta Catalina. Posteriormente, trataron otras propuestas matrimoniales con los reyes franceses Luis XII y Francisco I, el polaco Segismundo I o el duque Antonio de Lorena. También pudo tener un romance con Federico II conde Palatino del Rin, puesto que, en 1517, cayó en manos de su hermano Carlos una carta de amor del conde dirigida a ella. Carlos, tras descubrirla, les obligó a jurar que no estaban casados en secreto y expulsó a Federico de la corte de los Habsburgo. Ese mismo año, partió con su hermano a Castilla, donde éste debía ocupar el poder vacante tras el fallecimiento de su abuelo Fernando.
Siguiendo la política de los Habsburgo, de procurar ventajosos a nivel político, que, aseguraran el futuro de la dinastía, la comprometen con su tío, el rey Manuel I de Portugal, apodado el Afortunado, que era viudo de sus dos tías, Isabel y María, ambas, hermanas de su madre, uno vez que no llegaron a un acuerdo para casarla con su heredero el príncipe Juan, que se casaría con su hermana Catalina. El matrimonio se celebró en Lisboa, el 7 de marzo de 1519, fruto del cual nacerán dos hijos: Carlos y María. Cuando fallece el 13 de diciembre de 1521, Manuel I, con 52 años, Leonor tiene apenas 23, y decide retornar al lado de su hermano Carlos, teniendo que dejar en Portugal, a su hija María, de sólo seis meses. No volvería a verla en muchos años, la infanta portuguesa, jamás perdonó a su madre el abandono. En 1523, se la promete a Carlos III de Borbón, un noble francés que se oponía a Francisco I, no obstante, dicho matrimonio nunca tendría lugar.
La rivalidad entre Carlos I y Francisco I sacudía a Europa en una sangrienta lucha. Por lo que, cuando el rey francés es capturado por el monarca español y encarcelado, tras su derrota en la Batalla de Pavía, que tuvo lugar en 1525, se ve forzado a firmar el Tratado de Madrid de 1526, que pronto incumple, reanudándose las hostilidades; aunque si cumplirá el francés, una de las cláusulas; la que le compromete a casarse con Leonor de Habsburgo, que será celebrado ese mismo año en la Imperial Villa de Illescas (Toledo), pese a que el monarca francés no lo reconocería como tal, hasta firmar el 3 de agosto de 1529, el Tratado de Cambrai o de las Damas. Llamado así porque fue firmado por Luisa de Saboya —madre de Francisco I—, y Margarita de Austria —tía de Carlos I—. Tras la celebración de una nueva ceremonia, por poderes, en Torrelaguna, el 20 de marzo de 1530, a la que acudió la emperatriz Isabel, Leonor emprendió viaje a Francia junto a los dos hijos de Francisco I, el delfín Francisco y su hermano Enrique, duque de Orleans, que habían quedado como rehenes de Carlos V en 1526, siendo garantía de que su padre cumpliría el Tratado de Madrid y devolvería Borgoña. Como no lo cumpliera, el cautiverio de los príncipes duró más de cuatro años. En Fuenterrabía, se hizo un intercambio: los niños por cuatro toneladas de oro, a pesar de lo cual Francisco I no devolvió Borgoña. Leonor se había vuelto enfermiza, delicada, y estaba, además, afectada por elefantitis.
La vida de Leonor en la refinada y lujuriosa corte francesa fue difícil y angustiosa: viendo cómo su marido la rechazaba, desviando sus atenciones hacia otras mujeres. El intento del emperador de conseguir mejorar las relaciones con el rey francés, casando con él a su hermana, había resultado inútil. Fue un sacrificio más para Leonor. Francisco I, murió en Rambouillet, el 31 de marzo de 1547. Tras enviudar, Leonor fue nombrada duquesa de Turena; viuda y sin hijos de este matrimonio, regresó a la corte de Bruselas. Durante muchos años trató, ayudada por su hermano, el consentimiento del rey de Portugal para que su hija María viviera con ella.
Tras la abdicación de Carlos I en 1555, y su retiro a San Jerónimo de Yuste, Leonor y su hermana María deciden seguir a su hermano. Entonces, sucede lo inesperado: el rey Juan III de Portugal permite que la infanta María viviera junto a su madre. Pero los años de separación había sido demasiados, y una vez en España, la infanta regresa a Portugal. Para Leonor fue un duro golpe; su salud resentida salud, y el rechazo de su única hija fue más de lo que pudo soportar. Falleció en Talavera la Real, el 18 de febrero de 1558. Su hermana María la siguió el 18 de octubre del mismo año. Fue enterrada en la Concatedral de Mérida, hasta que su hermano Carlos I mandó que sus restos fueran trasladados al San Monasterio de Yuste.Aunque, actualmente, reposan en el Panteón de Infantes del Monasterio de El Escorial.
De su matrimonio con Manuel I de Portugal, tuvo dos hijos: Carlos y María.
Ramón Martín